Fazendo uma coloração de Gram: 18 etapas (com fotos)

3 partes:

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Prepara-se o diapositivo Realizar a coloração de Gram Examine o resultado

A coloração de Gram é um procedimento rápido e que é utilizada para procurar a presença de bactérias em amostras de tecido e caracterizá-los como negativo positivo ou Gram Gram com base nas propriedades químicas e físicas das suas paredes celulares. coloração de Gram é quase sempre feito como o primeiro passo no diagnóstico de um infecção bacteriana.

coloração de Gram é nomeado após o cientista dinamarquês Hans Christian Gram (1853 - 1938), que desenvolveu a técnica em 1882 e publicado em 1884 como uma técnica para distinguir entre dois tipos de bactérias com sintomas clínicos semelhantes: bactérias Streptococcus pneumoniae (Também conhecido como pneumococo) e Klebsiella pneumoniae.

parte 1Prepara-se o diapositivo

Prepare-se para o trabalho de laboratório. Coloque luvas e cinta em seu cabelo se você tiver tempo para evitar a contaminação da amostra de bactérias que iremos analisar. Desinfecta um espaço de trabalho sob o capô ou em outra área bem ventilada. Antes de começar, verifique se o queimador de Bunsen e do microscópio estão operacionais.

Esterilizar uma lâmina de vidro para microscópio. Se a lâmina estiver sujo, lave com água e sabão para remover gordura e sujeira. Desinféctalo com etanol, limpador de vidro ou o método recomendado pelo seu laboratório.

Colocar a amostra no slide. É possível utilizar o método de coloração de Gram para ajudar a identificar as bactérias presentes em amostras médicas ou culturas de bactérias numa placa de Petri. Para coloração de Gram é útil, ele coloca uma camada fino provar no slide. Recomenda-se que uma amostra tem menos de 24 horas, como a bactéria mais velhas pode ter danificado paredes das células que respondem forma menos previsível a mancha de Gram.

Se você estiver usando uma amostra de tecido, coloque 1 a 2 gotas da amostra na lâmina de vidro. Espalhe uniformemente sobre a lâmina de modo a formar uma mancha fina utilizando a extremidade de uma segunda corrediça de vidro esterilizado. Deixe-o ar seco antes de continuar.
Se você estiver indo para tomar as bactérias em uma placa de Petri, esteriliza uma alça bacteriológica em uma chama bico de Bunsen até que brilha, em seguida, deixe esfriar. Utilizar-se colocar uma gota de água estéril sobre a lâmina e, em seguida, esterilizadas e arrefece o identificador de novo antes de transferir uma pequena amostra das bactérias para a corrediça e agitar suavemente para dentro da água.
As bactérias num meio de cultura deve ser misturado em vortex e, em seguida, colocados na corrediça com alça bacteriológica, como indicado acima, mas sem adição de água adicional.
Se você tem uma amostra em um cotonete, passe um pouco acima do slide.

calor amostra fixa. Calor bactérias fixo para que o slide não é facilmente lavado durante a coloração. passando rapidamente a corrediça duas ou três vezes através da chama do bico de Bunsen ou aquecê-lo sobre um aquecedor eléctrico deslizante. Não sobreaquecer ou amostras podem ser distorcidas. Se você estiver usando um bico de Bunsen, a chama deve ser um pequeno cone, azul, ninguém alto e laranja.

Alternativamente, a amostra pode ser fixada com metanol, adição de 1 a 2 gotas no local seco, drenar o excesso de metanol e deixando-a secar ao ar. Este método minimiza os danos para as células hospedeiras, dando-lhes um fundo limpo.

Posicionar os slides em uma bandeja coloração. Uma bandeja para a coloração é um tabuleiro raso de metal, vidro ou plástico com um pequeno suporte de malha ou fio ao longo do topo. Coloque o slide no suporte para que o líquido pode drenar você estará usando na bandeja.

Se você não tiver uma bandeja para a coloração, o slide pode ser colocado diretamente em um balde de gelo de plástico.

parte 2Realizar a coloração de Gram

Mergulhe a amostra com violeta de cristal. Usar uma pipeta para absorver a amostra das bactérias com várias gotas de corante violeta cristal, às vezes chamado violeta de genciana. Espere por 30 a 60 segundos. Numa solução aquosa, de violeta de cristal (CV) CV + dissocia-se em iões cloreto e (Cl). estes íons penetram a parede celular e membrana celular de células em ambas Gram negativos e Gram positiva. CV + ião interage com componentes carregados negativamente das células bacterianas a manchas violetas.

Muitos laboratórios usam o cristal violeta "Hucker"Que acrescenta oxalato de amónio para evitar a precipitação.

Gentilmente lavar o cristal violeta. Incline a lâmina e utilizar um frasco de lavagem para pulverizar um pequeno riacho de água destilada ou toque na parte superior do slide. A água deve deslizar sobre a superfície da mancha, mas não ser apontado directamente a ele. Não lavar excessivamente, o que pode remover a mancha de bactérias Gram-positivas.

Mergulhe a mancha com iodo e depois enxaguar. Usar uma pipeta para cobrir a mancha com iodo. Deixe repousar por pelo menos 60 segundos, em seguida, enxaguar com o mesmo método. O iodo sob a forma de iões carregados negativamente, interage com os iões CV + para formar compostos de violeta de cristal grandes e iodo (composto CV-I), dentro das camadas interior e exterior da célula. Isto prende cristal cor violeta na célula, no lugar onde eles têm.

O iodo é corrosivo. Evitar a inalação, ingestão ou contato com a pele.

Fazer uma lixívia e depois enxaguar rapidamente. Para este passo crítico, é geralmente usado numa mistura de acetona e etanol numa razão de 1: 1. A conclusão desta etapa deve ser calculado com cuidado. Segure a lâmina em um ângulo, em seguida, adicione a água sanitária até que nada da cor violeta é visível no segundo turno. Isto normalmente leva menos de 10 segundos ou menos, mesmo se a descoloração contém uma elevada concentração de acetona. Pare imediatamente ou lixívia irá remover a coloração violeta cristal de células negativo e coloração positiva e Gram Gram serão repetidas. Imediatamente lavados excesso de descoloração usando a técnica acima mencionada.

Pode acetona pura (95% +) usada. A acetona mais lá, o branqueador vão trabalhar mais rapidamente, o que requer um cálculo mais preciso do tempo.
Se você está tendo problemas para calcular executar este passo, considere a adição gota a gota de lixívia.

Mergulhe a mancha com um corante secundário e depois enxaguar. um corante secundário, geralmente safranina ou fucsina é usado para adicionar um contraste adicional entre negativas positivas e Gram Gram, as bactérias vermelhas descoloridos (Gram negativos) ou rosa. Deixar o corante na amostra durante pelo menos 45 segundos, depois enxaguar.

bactérias negativas mancha Fucsina muitas bactérias gram mais intensamente, como espécies Haemophilus e Legionella. Isso pode torná-lo um melhor escolha para iniciantes.

Seque o slide. Você pode parar o slide ao ar seco ou seque com papel absorvente é vendido para esta finalidade. A coloração de Gram é concluída.

parte 3Examine o resultado

Prepara-se o microscópio óptico. Colocar a lâmina sob o microscópio. Bactérias variam muito em tamanho, de modo que o total necessário irá variar de 400x de ampliação em 1000x. Na extremidade mais elevada destas ampliações, recomendamos o uso de uma lente objetiva com óleo de imersão para maior clareza. Coloque uma gota de óleo de imersão no slide, impedindo o movimento durante a aplicação para evitar bolhas. Mover o revólver microscópio de modo que a lente da objectiva está posicionado no lugar com um clique, tocar o óleo.

lentes de imersão em óleo só pode ser utilizado em especialmente concebidos, e não de uma lente "seca".

Identifica negativas positivas e Gram Gram. Examinar a lâmina sob o microscópio. As bactérias Gram positivas será devido ao violeta cristal violeta preso nas suas paredes celulares espessas. bactérias Gram negativas vai ser rosa ou vermelho, como violeta lavado através de paredes celulares finas e, em seguida, se juntou a eles corante secundário rosa.

Se a amostra for muito grosso, você pode obter falsos positivos. Tinge uma nova amostra se todos os seus resultados são Gram positivas, para garantir que o resultado está correto.
Se a lixívia correu por muito tempo, você pode obter falsos negativos. Tinge uma nova amostra se todos os seus resultados são Gram negativo para analisar os resultados duas vezes.

imagens de referência da pesquisa. Se você não tem certeza que é uma bactéria, busca coleções de imagens classificadas por formulário de referência e os resultados da coloração de Gram. Você pode encontrar bancos de dados on-line no Banco de Dados Nacional de Microbial Pathogens EUA, Bactérias em fotos e muitos outros sites. Para facilitar ainda mais a identificação, comum ou importantes para exemplos de diagnóstico são classificados abaixo por status Gram e forma.

Bactérias gram-positivas identificadas pela sua forma. As bactérias são ainda classificados pela sua forma sob o microscópio, mais comumente, como cocos (esférica) ou hastes cilíndricas (). Aqui estão algumas bactérias positivas comum grama (violeta manchado) classificados pela forma:

cocos Gram positivos geralmente eles são ou estafilococos (que significa cocos em grupos) ou estreptococos (o que significa cocos em correntes).
Bastonetes Gram positivos Eles incluem bacilos e bactérias Clostridium, Corynebacterium e Listeria. Os pólos da espécie Actinomyces muitas vezes eles têm filiais ou filamentos.

Identifica bactérias Gram-negativas. As bactérias Gram negativas (tingido rosa) são geralmente classificadas em três grupos. O cocos são bactérias esféricas, as hastes são bactérias longas e finas, e as hastes cocóide estão em algum lugar no meio.

cocos Gram negativo são mais comumente as espécies Neisseria.
Bastonetes Gram negativos bactéria incluem E.coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteu, Salmonella, Shigella, Pseudomonas e muitos outros. bactérias Vibrio cholerae ele pode aparecer como hastes normais ou hastes curvas.
Bastonetes Gram negativos "cocoides" (ou "coccobacillary") incluem Bordetella, Brucella, Haemophilus e Pasteurella.

Avalia resultados mistos. Algumas bactérias são difíceis de tingir precisamente por causa da fragilidade das suas paredes celulares ou cerosa como eles são. Eles podem ter uma mistura de um ou de coloração violeta-de-rosa na mesma célula, ou entre células diferentes na mesma amostra. Qualquer amostra de bactérias que tem mais do que 24 horas pode ter este problema, mas algumas espécies são difíceis de tingir em qualquer idade. Eles podem exigir testes mais especializados para reduzir o número de possibilidades de identificação, tais como Ziehl-Neelsen, observando o crescimento das culturas, agar TSI ou testes genéticos.

espécies Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium e Propionibacterium bactérias gram-positivas são consideradas, mas muitas vezes são coradas de forma inconclusiva.
bactérias pequenas e finas, como as espécies Treponema, Chlamydia e Rickettsia, Eles são difíceis de tingir adequadamente.

materiais descartados. Os procedimentos para a eliminação de resíduos de acordo com variam entre os laboratórios e os materiais utilizados. Tipicamente, o líquido no tabuleiro para a coloração descartado como lixo perigoso em garrafas vedadas. Mergulhar as lâminas em uma solução com 10% de água sanitária e, em seguida, colocá-las em recipientes para instrumentos afiados.

dicas

Lembre-se que o desempenho da coloração de Gram é apenas tão bom quanto o espécime. É importante ensinar os pacientes a prestar bons espécimes (por exemplo, ensinar-lhes a diferença entre um espeto e uma amostra de escarro tosse profunda).
Como descorante, etanol actua mais lenta do que a acetona.
Siga as precauções padrão para o laboratório.
Utilize um cotonete boca para a prática, uma vez que a amostra deve conter bactérias tanto negativas positivas e Gram Gram. Se você só vê um ou outro tipo de bactéria, você provavelmente usada lixívia muito pouco ou muito.
Você pode usar um de madeira molas prendedor de roupa para segurar o slide.

avisos

Acetona e etanol e acetona são inflamáveis secar as mãos. Use luvas e manipúlalos com cautela.
Não deixe que a mancha seca antes de enxaguar o corante ou corante secundário.